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    細胞培養(yǎng)常遇到的問題解決辦法

    發(fā)布時間： 2022-10-24　　點擊次數(shù)： 1160次

    養(yǎng)細胞是一件勞心勞力的事。要像照顧小孩一樣仔細對待，愛護它，呵護它。這次就來講講細胞培養(yǎng)常見問題的原因及解決辦法。




    1 培養(yǎng)液 pH 值變化太快


     原因：


    • CO2 張力不對

    • 培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊

    • NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足

    • 培養(yǎng)液中鹽濃度不正確

    • 細菌、酵母或真菌污染


     解決辦法：


    • 按培養(yǎng)液中 NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi) CO2 濃度，2.0 g/L 到 3.7 g/L 濃度 NaHCO3 對應(yīng) CO2 濃度為 5％ 到 10％。或者改用不依賴 CO2 培養(yǎng)液

    • 松開瓶蓋 1/4 圈

    • 加 HEPES 緩沖液至 10 到 25 mM 終濃度

    • 在 CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于 Earle’s 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用 Hank’s 鹽配制的培養(yǎng)液

    • 丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌





    2 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，pH 值不變


    原因：


    • 用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來

    • 冰凍保存培養(yǎng)液


    解決辦法：


    • 用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后除菌

    • 將培養(yǎng)液加熱到 37 ℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液





    3 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，同時 pH 發(fā)生變化


    原因：


    • 細菌或真菌污染


    解決辦法：


    • 丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌




    4 培養(yǎng)細胞不貼壁


     原因：


    • 胰蛋白酶消化過度

    • 支原體污染

    • 培養(yǎng)液中無貼壁因子


    解決辦法：


    • 縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度

    • 分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物

    • 改變培養(yǎng)液成分


    5 懸浮細胞成簇




    原因：



    • 培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子

    • 支原體污染

    • 蛋白酶過度消化使得細胞裂解釋放 DNA



    解決辦法：



    • 用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞，輕輕吹吸細胞獲得單細胞懸液

    • 分離培養(yǎng)物，檢測支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物

    • 用 DNase I 處理細胞



    6 原代細胞培養(yǎng)物污染




    原因：



    • 原代培養(yǎng)組織在進入培養(yǎng)前已污染



    解決辦法：



    • 培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織



    7 培養(yǎng)細胞死亡


    原因：


    • 培養(yǎng)箱內(nèi)無 CO2

    • 培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大

    • 細胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷

    • 培養(yǎng)液滲透壓不正確

    • 培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積


    解決辦法：


    • 檢測培養(yǎng)箱內(nèi) CO2

    • 檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度

    • 取新的保存細胞種

    • 檢測培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動物細胞能耐受滲透壓為 260~350 mOsm/kg。加入額外試劑如 HEPES 或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。

    • 換入新鮮培養(yǎng)液


    8 培養(yǎng)細胞生長減慢




     原因：



    • 由于更換不同培養(yǎng)液或血清

    • 培養(yǎng)液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞

    • 培養(yǎng)物中有少量細菌或真菌污染

    • 試劑保存不當

    • 接種細胞起始濃度太低，細胞已老化

    • 支原體污染



    解決辦法：



    • 比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗。讓細胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液

    • 換入新鮮配制培養(yǎng)液。補加谷氨酰胺或生長因子

    • 用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物。或用抗生素除菌

    • 血清需保存在 -5 ℃ 到 -20 ℃。培養(yǎng)液需在 2~8 ℃ 避光保存。含血清*培養(yǎng)液在 2~8 ℃ 保存，并在 2 周內(nèi)用完

    • 增加接種細胞起始濃度，換用新的保種細胞

    • 分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物




    9 保存血清最合適的方法是？


    建議血清應(yīng)保存在 -5 ℃ 至 -2O ℃。然而，若存放于 4 ℃ 時，請勿超過一個月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。





    10 如何解凍血清不會使其質(zhì)量受損？


    建議將血清從冷凍箱取出后，先置于 2～8 ℃ 冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地搖晃均勻。



    11 血清解凍后有絮狀沉淀物怎么辦？


    血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最為普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。


    但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以 400 g 稍微離心，上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因為它可能會阻塞您的過濾膜。





    12 為什么要熱滅活血清？


    加熱可以滅活補體系統(tǒng)。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng) ES 細胞，昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。



    13 有必要做熱滅活嗎？



    實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，而造成細胞生長速率的降低。


    而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是「小黑點」，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37 ℃ 環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。




    14 儲存冰箱中的胎牛血清出現(xiàn)沉淀？



    GIBICO 的胎牛血清沒有預(yù)老化，儲存在 2~8 ℃ 時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在 -20 ℃ 儲存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。




    15 如何避免沉淀物的產(chǎn)生？


    解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法（-20 ℃ 至 4 ℃ 至室溫），若血清解凍時改變的溫度太大（如 -20 ℃ 至 37 ℃），實驗顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物。


    解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。


    請勿將血清置于 37 ℃ 太久。若在 37 ℃ 放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。


    血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。若必須做血清的熱滅活，請遵守 56 ℃，30 分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。



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